冠状病毒在水和废水中的存活

译文来源：Patricia M. Gundy, Charles P. Gerba，Ian L. Pepper. Survival ofcoronaviruses in water and wastewater[J].Food Environ Virol,2009,1(1):10–14.

翻译：哈尔滨工业大学 王路遥;校对：哈尔滨工业大学陈志强教授，西湖大学 鞠峰教授(备注：疫情时期，本文的翻译是为了使大家更好地了解风险防控知识，如有不当之处，请批评指正)

摘要：严重急性呼吸综合征的出现及其潜在的环境传播表明，需要更多关于冠状病毒在水和废水中存活的信息。在过滤和未过滤的自来水(4℃和23℃)和废水(23℃)中测定了代表性冠状病毒猫传染性腹膜炎病毒和人冠状病毒229E的存活率。在相同的试验条件下，将其与脊髓灰质炎病毒1型进行了比较。试验水中冠状病毒的失活高度依赖于温度、有机物水平和拮抗细菌的存在。病毒效价下降99.9% (T99.9)所需的时间表明，在自来水中，冠状病毒在23℃ (10天)水中比在4℃ (>100天)水中灭活得更快。冠状病毒在废水中迅速死亡，T99.9值在2～4天之间。除了4℃自来水外，脊髓灰质炎病毒在所有测试水中的存活时间都比冠状病毒长。

01

介绍

2003年严重急性呼吸系统综合症(SARS)在全世界造成了8000多例病例产生，死亡率约为10%(Manocha et al. 2003;Centers for Disease Control 2004)。最后已知的爆发是在2004年北京的一个研究实验室。这种疾病的原因被确定为一种新的人类冠状病毒，很可能起源于麝猫，潜在宿主可能是蝙蝠(Guan et al. 2003; Lau et al. 2005; Wang et al. 2006)。冠状病毒是有包膜的单链RNA病毒，大小从60～220纳米不等。它们可以感染鸟类和哺乳动物，包括人类，并通过气溶胶或粪便-口腔途径传播。冠状病毒在爆发期间的迅速传播表明，人类冠状病毒的主要传播方式是呼吸道飞沫;然而，没有直接证据支持这一点(Belshe 1984)。由于迄今为止人类冠状病毒感染被认为是一种温和的、自我限制的疾病，因此关于其在环境中的传播潜力的信息有限。

鉴于2003年3月在香港高层住宅区爆发的涉及300多人的SARS疫情与一个有缺陷的污水系统有关(Peiris et al. 2003)，SARS疫情传播可能与水和废水有关。SARS-CoV可在肠道内复制 (Leung et al. 2003)，这一事实使其成为一种可能的肠道病原体，而SARS病例中腹泻的发生率在8%～73%之间(SARS流行病学工作组，2003)，这引起了人们对其潜在环境传播的关注。Leung等人(2003)还报道，从SARS患者小肠中获得的病毒培养物产量高于作为该病毒靶器官的肺组织。传染性病毒是从SARS患者感染后3周内的粪便中分离出来的(Chan et al. 2004; Liu et al. 2004)。SARS的出现及其传播问题表明需要更多的信息，特别是冠状病毒在水和废水中的存活情况。本研究比较了代表性冠状病毒和脊髓灰质炎病毒1型在自来水和废水中的存活情况。

02

材料和方法

猫传染性腹膜炎病毒(FIPV) (ATCC-990)：一种猫科动物的肠道冠状病毒，在克兰德尔里瑟猫肾细胞系(CRFK) (ATCC-94)中繁殖和检测。人冠状病毒229E (HCoV) (ATCC-740)：一种呼吸道病毒，在胎儿肺成纤维细胞，MRC-5细胞系(ATCC-171)中繁殖和分析。脊髓灰质炎病毒1 LSc-2ab (PV-1)：一种已知的在环境中非常稳定的人类肠道病毒，在布法罗绿猴肾(BGM)细胞系中繁殖和检测。在单层细胞中观察到细胞致病作用(CPE)后，将感染细胞在-20℃冷冻和解冻三次以释放病毒。随后在1000g离心10分钟以除去细胞碎片，加入到9%聚乙二醇(相对分子质量8000)和0.5 M氯化钠的病毒悬浮液中，并在4℃下搅拌过夜。在10000g离心30分钟后，用0.01 M磷酸盐缓冲盐水(PBS; pH 7.4)(Sigma, St. Louis, MO)重悬至原始病毒悬液体积的5%。然后将冠状病毒进行效价测定并储存在-80℃下。脊髓灰质炎病毒通过用等体积的Vertrel XF (Dupont, Wilmington，DE)提取进一步纯化，乳化后以7500g离心15分钟，随后收集顶层水层，进行效价测定并在-80℃储存。

自来水样本是从实验室的冷水龙头中采集的。水源是地下水，水质参数: pH 7.8，溶解固体297mg/L，总有机碳0.1mg/L。在收集样品之前，让水流动3分钟。在未过滤的自来水和通过0.2μm孔径过滤器去除细菌的自来水中测定病毒存活率。将自来水(30mL)加入到无菌的50mL聚丙烯离心管中，以减少附着在容器上的病毒损失。添加无菌硫代硫酸钠至最终浓度33μg/mL，以使水脱氯。涡旋后，将病毒添加到每个管中，最终浓度为105 TCID50/mL。再次涡旋离心管并立即取样(零时间点)。然后将离心管储存在4℃或室温下(23℃)。室温下储存的离心管用铝箔覆盖，以防暴露在光线下。在1、3、6、10、15和21天后对离心管取样，并将样品在-80℃下冷冻，直到它们在细胞上被分析。 初级出水和剩余活性污泥(二级)的样品来自于美国亚利桑那州图森市罗杰路污水处理厂，并收集在无菌聚丙烯瓶中。沉淀后收集初级出水，氯化前收集二级出水。该设施一级出水的典型水质参数为生物需氧量(BOD)和1悬浮固体(10～220mg/L)。通常相比初级出水，二级出水中的BOD和悬浮固体减少了90%～95%。将出水(30mL)加入到无菌的50mL聚丙烯离心管中。在添加病毒之前，一级出水通过0.2μm孔径的过滤器过滤，并且未经过滤的也进行测试。二级出水仅未经过滤的进行测试。然后将病毒添加到每个离心管中，最终浓度为105 TCID50/mL。将离心管涡旋，立即取样(零时间点)。然后将离心管覆盖并保持在室温(23℃)。在1、2、3、6、10、15和21天后收集样品，并将样品在-80℃下冷冻直至分析。 使用噬斑试验或TCID50技术在细胞培养物上计数病毒。在6孔塑料细胞培养板中，通过噬斑测定法(Payment and Trudel 1993)测定了PV-1的效价。这是一种直接定量方法，最低检测限为10 pfu/mL。将每种稀释液接种在两个孔中。在细胞培养中不形成斑块的冠状病毒，通过组织培养感染剂量50%技术(TCID50)在24孔塑料细胞培养板中测定其效价(Payment and Trudel 1993)。这种技术确定了显示出CPE的50%的原液的稀释度。取稀释倍数的反对数，得到每毫升TCID50的病毒效价。该方法的最低检测值为每毫升3.7个病毒。将每种稀释液接种在至少8个孔中。在添加病毒之前，任何来自测试水的样品都必须在细胞培养检测之前过滤，以消除细菌污染。在pH为7下使3%牛肉提取物(Becton Dick-inson，Sparks，MD)通过以阻断可能吸附病毒的位点来制备具有聚醚砜(PES)膜的0.2 μm低蛋白结合Millex过滤器(Millipore, Billerica, MA)。所有实验重复三次。

编辑：王媛媛