发光细菌暗变种检测环境样品致突变性

童中华 胡洪营 魏东斌
(清华大学环境科学与工程系 环境模拟与污染控制国家重点联合实验室 北京 100084)

　　在发光细菌的应用过程中人们发现并分离出了它的自发暗变种（K变种），如1980年Ulitzue等从鲋鱼发光杆菌P. leiognathifenli分离到自发暗变种，并根据化合物使暗变种恢复发光的能力检测其致突变性，证明在各种碱基置换剂和移码剂存在下，可大大提高暗变种在世代中的回复突变率。文献证明DNA合成抑制剂和DNA插入剂也可提高其回复突变率。该项技术已被美国Azur公司（原Microbics公司）定名为Mutatox^TM方法。
　　顾宗濂于1993年首次在国内报道利用自行分离到的明亮发光杆菌的自发暗变种T9171菌株，测试五种遗传毒物的致突变性，指出暗变种对化合物致突变效应的灵敏度高于Ames试验，发光细菌暗变种试验可望成为一种简易灵敏的生物致突变性测试方法。
　　本文对发光细菌暗变种的检测原理、测试方法和应用研究作简要介绍，并与Ames试验进行比较，以推进暗变种方法在我国环境监测中的研究和应用。

1. 检测原理
　　对发光细菌经过理化方法诱变处理后，使其失去发光能力或发光强度极弱，称为暗变种（K. variant）。若暗变种接触致突变物，在世代分裂时可导致突变，恢复一定程度的发光能力。利用暗变种恢复发光的现象，可对各种遗传毒物或环境样品进行筛选、检测。这可能是由于致突变物使调节基因发生突变，使其不能产生或产生无活性的抑制物质，也可能使DNA双链发生构象改变，使抑制物质不能与之结合而失去抑制效应，总之，真正的回复突变机理目前还不清楚。

2. 测试方法
　　AZUR 公司采用费氏弧菌Vibrio fischeri 的暗变种M 169，制成冻干粉于-20℃保存，测定前复苏，在27-30℃与待测物接触16，20，24小时或更长时间以后检测发光强度，同时做阴性和阳性对照。一般规定，对某一化合物的所有测试浓度，若样品发光比阴性对照发光≤2，则认为该化合物无致突变性；若样品的发光为阴性对照的至少2倍，则认为反应阳性，至少连续2个浓度为阳性才能确定为有致突变性。
　　顾宗濂在研究初期采用暗变种的新鲜培养液，20℃环境中待测物与培养液在测定管中静止培养，于0，14小时以后每隔4小时测发光强度，至各管发光强度达最大值后明显下降为止。若样品的最大发光值为同一时间空白对照的至少2倍，则认为反应阳性。1999年谢思琴、顾宗濂等报道了采用4℃保存的暗变种冻干粉，20℃振荡复苏，与待测化合物接触振荡培养24小时后每隔3-4小时测定一次发光强度。以样品发光强度为空白对照的3倍者为阳性效应，若样品的5个平行系列中有3个阳性效应，即认为该样品具有致突变性；若样品的平行系列中阳性效应数不足3个，则认为阳性可疑。

3. Mutatox与Ames试验的方法比较
　　Mutatox与Ames试验属于体外致突变性检测方法，都是细菌法，使用大鼠肝脏提取液S9作为代谢活化因子。Mutatox与Ames试验相比具有快速、简便等特点，具体从以下几点加以讨论：
　　(1) Mutatox试验中使用的发光细菌暗变种是从AZUR 公司购买的真空包装冻干粉，-20℃保存，测试菌株不需要进行预试验，复苏冻干粉即可用于试验。Ames试验中菌液准备工作量大。冷冻保存的菌种先进行增菌培养，然后进行菌株生物学性状的鉴定，若生长及生物学性状不符合要求，应对其进行划线分离。此外还要进行例如各种培养基、营养液的准备和灭菌等准备工作。
　　(2) Mutatox试验不需要严格的无菌条件。一般情况下Mutatox测试不受环境中存在的非发光细菌的影响，只有当杂菌的浓度过大（约大于105/mL）时才需要用0.22μm的膜进行过滤。同时，Mutatox测试介质含有高浓度盐、低浓度营养液和一些广谱性抗菌素，相对高浓度测试菌株的加入，以及测试终点的检测特点，大大降低了可能进入测试系统的杂菌对测试结果的影响。Ames试验需要进行严格的无菌操作，对工作人员的微生物实验技能要求较高。因为杂菌的存在会严重影响平皿渗入法计算回变菌落数。
　　(3) Mutatox方法不需要繁琐且昂贵的连续培养，批量生产的冻干粉保证了其品质的稳定性，并能减小其遗传变异。试验一般只需要24小时即可完成，操作简便、花费低。Ames试验一般需要48-72小时完成，要配制多种培养基，所需材料多、费用高、费时较多。
　　(4)为了使Mutatox方法标准化，已经有大量的工作比较了Mutatox方法与Ames试验对单一化合物和环境样品致突变性检测的灵敏度和准确性。Johnson B.T. 对8种典型致突变前体物的检测结果证明，Mutatox方法和Ames试验在定性和定量两方面的灵敏度相近，Mutatox方法可成为检测复杂环境中致突变物质的一个有效的监测手段。谢思琴、顾宗濂等对发光细菌暗变种T9171的灵敏度进行了研究，结果充分说明T9171试验与Ames试验检测遗传毒物所反映的遗传毒性水平具有较好的一致性。

4．应用
　　近年来，科学工作者已经用发光细菌暗变种检测出100多种单一化合物的致突变性，同时也用于检测各种环境样品的致突变性。Kwan等用Mutatox方法测试了河水和沉积物的有机提取物的致突变性，同时检测了其急性和慢性毒性，证明Mutatox是成组试验（battery of tests）中有用的方法。Békaert等利用Ames和Mutatox试验、活体两栖动物微核试验对被PAHs和重金属污染的土壤浸出液进行致突变性检测，通过非过滤样品和过滤样品的比较试验，指出Mutatox试验中样品不经过0.45μm膜过滤能更准确地检出颗粒物上吸附的生物活性污染物的致突变性。
　　此外，Johnson用Mutatox和Microtox方法测定了50多种农药、致突变剂和工业污染物，Mutatox方法对各种化合物的敏感性与文献报道的Ames实验结果相一致，统计分析结果表明急性毒性和致突变性之间存在着明显的相关性（p<0.05），并利用这两种方法测试了8个有机沉积提取物。
　　1993年以来，我国学者利用明亮发光杆菌的自发暗变种T9171进行了一些研究工作。首先研究了T9171暗变种对5种已知的致突变剂的回复突变效应，利用所建立的实验方法检测了工业废渣的致突变效应，结果与Ames试验结果的趋势相似。将暗变种T9171制成冻干粉，采用改进的实验方法研究了36种有机化合物的致突变效应，并与Ames试验比较，以一致阳性的受试物最低剂量进行相关分析，在0.01的显著性水平上两种方法的吻合率达69%。赵华清等将此方法应用于环境样品中，检测了14种环境水样和9种化合物的基因毒性，结果说明加S9能大大提高发光细菌暗变种的检测灵敏度。

　　Mutatox方法在国际上已经得到了一定程度的应用，但是由于冻干粉价格相对较高，很难在我国推广。我国学者自行分离出暗变种T9171，并进行了初步的研究，但该法的测定步骤及其判断标准还有待于进一步完善。随着简便、快速、经济的发光细菌暗变种测试方法的逐步成熟，并与其它化学和生物测试方法联合，应用前景将会非常广阔。